（1）加熱滅菌法

 

利用高溫來(lái)殺死微生物（超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度）的方法。加熱滅菌的原理：當(dāng)高溫作用于微生物時(shí)，首先引起細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)速率加快，機(jī)體內(nèi)對(duì)溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體的變化、酶結(jié)構(gòu)的破壞，從而使細(xì)胞失去了生活機(jī)能上的協(xié)調(diào)，停止了生長(zhǎng)發(fā)育。隨著高溫的繼續(xù)作用，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結(jié)構(gòu)完全破壞，活動(dòng)消失，生化反應(yīng)停止，滲透交換等新陳代謝活動(dòng)消失，細(xì)胞死亡。加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。

 

1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒(méi)有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱為干熱滅菌法。由于干熱滅菌使用方便，方法簡(jiǎn)單，故在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱焚燒滅菌法。采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來(lái)滅菌。

 

2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。

 

①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強(qiáng)的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時(shí)間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細(xì)菌的芽孢在120℃，經(jīng)20～30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時(shí)，可將壓力增加到0.152兆帕，延長(zhǎng)至1～2小時(shí)。在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。

 

 

 

圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋

 

在使用高壓滅菌鍋時(shí)，要完全排出鍋內(nèi)的空氣而以飽和蒸汽代之。如果空氣不排除干凈，則鍋內(nèi)溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。

 

此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養(yǎng)基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。所采用的蒸汽壓力與時(shí)間，應(yīng)根據(jù)待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類型等決定。

 

②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。它設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低，當(dāng)前使用最廣泛。只要砌一個(gè)爐灶，買1～2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過(guò)大，以裝800～1500瓶為好。設(shè)計(jì)常壓灶時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來(lái)定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內(nèi)壁下流而不會(huì)打濕棉塞；灶倉(cāng)內(nèi)要有層架結(jié)構(gòu)，以便分層裝入滅菌物；灶上應(yīng)安裝溫度計(jì)，可隨時(shí)觀察灶內(nèi)溫度的變化；因滅菌時(shí)間長(zhǎng)，鍋內(nèi)水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉(cāng)的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節(jié)省燃料。菇農(nóng)在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。這種方法不用建灶，簡(jiǎn)便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開(kāi)后保持8～10小時(shí)，悶一夜即可。

 

 

 

圖2-7 簡(jiǎn)易常壓滅菌法

 

③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復(fù)幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內(nèi)，100℃處理1小時(shí)左右，殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，讓其冷卻至30℃左右，此時(shí)芽胞會(huì)萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復(fù)3次，可達(dá)到滅菌目的。該方法可用于不耐高溫的藥品、營(yíng)養(yǎng)物、特殊培養(yǎng)基的滅菌。

 

④低溫巴氏滅菌法 即在60～70℃下，經(jīng)一定時(shí)間，殺死有害微生物的方法。適應(yīng)于不耐高溫的物品消毒。有些培養(yǎng)基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營(yíng)養(yǎng)體，又能使培養(yǎng)基的成分不致受到嚴(yán)重破壞。食用菌生產(chǎn)中培養(yǎng)料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個(gè)原理殺死其中的病蟲(chóng)、雜菌。

 

（2）過(guò)濾除菌法

 

又分液體過(guò)濾和空氣過(guò)濾兩種，就是采用機(jī)械的方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器，通過(guò)機(jī)械過(guò)濾，只讓液體培養(yǎng)基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達(dá)到除菌的目的。這種方法適用于對(duì)熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基（如動(dòng)物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺(tái)的工作原理就是將帶菌空氣通過(guò)過(guò)濾滅菌形成無(wú)菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來(lái)造成工作臺(tái)范圍的無(wú)菌狀態(tài)。過(guò)濾滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過(guò)濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。

 

（3）輻射滅菌法

 

利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線、β-射線、γ-射線、X-射線、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線、臭氧、日光為非電離輻射。

 

1）紫外線滅菌 紫外線殺菌的原理是利用紫外線的輻射作用。用燈管直接照射細(xì)菌使其發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，將細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復(fù)制而發(fā)生變性、致死。另一方面，空氣在紫外線照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線的有效作用距離為1.2～2.0米。紫外燈一般懸吊在接種室或培養(yǎng)室的上方，個(gè)數(shù)依房間大小而定，容1～2個(gè)人操作的接種室，安裝一個(gè)30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應(yīng)將所需的器具一起放入接種室（箱）內(nèi)，然后打開(kāi)紫外燈照射。如果接種室體積較大，開(kāi)燈照射2小時(shí)才能達(dá)到滅菌效果；如果較小，只需開(kāi)燈半小時(shí)左右既可達(dá)到滅菌效果。由于紫外線穿透力弱，即使是普通玻璃也不能濾過(guò)，因此，只適于空氣或物體表面的滅菌。紫外線對(duì)人體皮膚，尤其是眼睛有殺傷作用，應(yīng)避免直視，工作時(shí)應(yīng)將紫外燈關(guān)閉。紫外線消毒時(shí)工作場(chǎng)所如果處在稍暗無(wú)光的情況下，能提高殺菌效果。細(xì)菌接受致死量紫外線照射后，隨即給予可見(jiàn)光照射，部分細(xì)菌有復(fù)活的可能。干細(xì)胞比濕細(xì)胞對(duì)紫外線的抗性強(qiáng)，孢子比其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞對(duì)紫外線更具抗性。

 

2）微波滅菌 由于微生物的細(xì)胞中都含有70%～90%的水分，水分子在微波電場(chǎng)中被極化，并隨著電場(chǎng)方向的改變而轉(zhuǎn)動(dòng)，在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中分子之間高速度摩擦產(chǎn)生熱能，這種熱能不同于外部加熱，可在短時(shí)間里使細(xì)胞爆破而物體本身的溫度卻只有極微增加，從而達(dá)到滅菌效果。用YM7601型微波爐只需60秒鐘就能殺死食品中192萬(wàn)個(gè)大腸桿菌。

 

3）臭氧發(fā)生器消毒 臭氧（O3）具有強(qiáng)烈的氧化作用，能破壞微生物的細(xì)胞膜與核酸。O3也是一種暫態(tài)物質(zhì)，常溫下能自然分解，還原成氧。其滅菌原理實(shí)際上和紫外線消毒極相似。